دانلود پایان نامه

2009).
استافيلوکوکوسها سلولهاي کروي شکل به قطر 1 ميکرون هستند که در دستههاي نامنظم شکل ميگيرند. کوکسي تازه آن در رنگ آميزي گرم به شدت گرم مثبت است و در کشت کهنه بسياري از سلولهاي آن گرم منفي رنگ ميگيرند. استافيلوکوکوسها غيرمتحرک و فاقد اسپور هستند (بروکس و همکاران، 2010).

2-2- ساختار و ترکيب:
ديواره سلولي استافيلوکوکوسها شامل پروتئين و پليساکاريد است. يک پروتئين با عنوان فاکتور تودهاي کننده2وجود دارد که در شرايط آزمايشگاهي با فيبرينوژن فعل و انفعالاتي انجام ميدهد و ايجاد يک واکنش آگلوتيناسيون ميکند. پروتئين ديگر، پروتئين آ است که با ترکيب شدن با قطعه FC ايمنوگلوبولينها تودهاي را تشکيل ميدهد. عمده پليساکاريد ديواره سلولي اسيد تيکوئيک متصل به پپتيدوگليکان است. رنگدانههاي کاروتنوئيد در ديواره سلولي ميتواند رنگ طلايي را در کلونيهاي استافيلوکوکوس اورئوس ايجاد کند. گاهي اوقات استافيلوکوکوس اورئوس کپسول توليد ميکند و گاهي نيز يک کپسول کاذب که به سستي در ارتباط با يک ساختار کربوهيدرات است توسط سويههايي که ايجاد ورم پستان در گاو ميکنند، توليد ميشود (هيرش و همکاران، 2004).
3-2- ويژگيهاي رشد:
استافيلوکوکوسها به راحتي در اکثر محيطهاي کشت باکتري تحت شرايط هوازي و ميکروائروفيل رشد ميکنند. اکثر گونههاي آن بيهوازي اختياري اند و در محيط حاوي 10% کلريد سديم و محدوده دمايی C° 18-40 رشد ميکنند. محيط معمول براي تلقيح نمونهها محيط آگارحاوي خون گاو يا گوسفند ميباشد. محيط برد – پارکر آگار و مانيتول سالت آگار محيط انتخابي استافيلوکوکوس محسوب ميشود که معمولا در ميکروب شناسي مواد غذايي کاربرد دارند. اين ميکروارگانيسم در دمای C° 37 به سرعت رشد ميکند، اما تشکيل رنگدانه در دماي اتاق (C° 25-20) بهتر شکل ميگيرد. کلونيها روي محيط جامد گرد، صاف، برجسته و براق هستند (کويين و همکاران، 1994).
استافيلوکوکوس اورئوس معمولا کلونيهاي خاکستري تا زرد طلايي ايجاد ميکند. استافيلوکوکوس اپيدرميديس3 معمولا کلونيهاي خاکستري تا سفيد رنگ در جداسازي اوليه توليد ميکند. بسياري از کلونيها در اثر گرمخانه گذاري طولاني مدت توليد رنگدانه ميکنند. در محيط مايع و در شرايط بيهوازي هيچ رنگدانهاي توليد نميشود. درجات مختلفي از همموليز توسط استافيلوکوکوس اورئوس و گاهي توسط گونههاي ديگر توليد ميشود. استافيلوکوکوسها به آرامي بسياري از کربوهيدراتها را تخمير ميکنند و توليد اسيد لاکتيک بدون ايجاد گاز ميکنند. فعاليت پروتئوليتيک از سويهاي به سويه ديگر متفاوت است (بروکس و همکاران، 2010).
4-2- جداسازي:
محيط کشت آگار حاوي خون گاو بهترين محيط براي تشخيص توکسين β است که اين خود عامل تشخيصي براي استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز مثبت از جمله استافيلوکوکوس اينترمديوس4، استافيلوکوکوس شليفري5 و استافيلوکوکوس اورئوس مي باشد (هيرش و همکاران، 2004).
براي جداسازي ارگانيسمها از نمونههاي بسيار آلوده، نمونهها را ميتوان روي محيط CNA6 و يا PEA7 تلقيح کرد. اين دو محيط مانع از رشد باکتريهاي گرم منفي ميشوند و به باکتريهاي گرم مثبت اجازه رشد ميدهند. مانيتول سالت آگار يک محيط انتخابي مناسب براي ارزيابي حضور استافيلوکوکوس اورئوس در نمونههايي از قبيل نمونههاي اخذ شده از بيني ميباشد. در محيط کشت آگار حاوي خون گوسفند اکثر استافيلوکوکوسها در مدت 24 ساعت به خوبي رشد ميکنند. بعضي از گونههاي استافيلوکوکوس ممکن است بر اساس اين که نمونه حاوي کشت خالص است يا مخلوط به بيش از 48-24 ساعت گرمخانه گذاري نياز داشته باشند (وين و همکاران، 2006).
5-2- شناسايي و ويژگيهاي کلوني:
کلونيهاي اکثر گونههاي استافيلوکوکوس بعد از 24 ساعت گرمخانه گذاري قطر 3-1 ميلي متر و يا کمتر دارند. کلونيهاي استافيلوکوکوس معمولا گرد، صاف، کروي، برجسته، براق و داراي مقطع عرضي محدب و حاشيه مشخص ميباشند. کلونيهاي بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس معمولا بزرگ، صاف و کروي هستند، در حالي که بعضي سويهها ممکن است ظاهري خيس و چسبناک داشته باشند.
1-5-2- توليد رنگدانه:
استافيلوکوکوسها در دماي اتاق بهتر رنگدانه توليد ميکنند. بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس ممکن است رنگدانه زرد يا زرد – نارنجي توليد کنند، در حالي که ديگر سويههاي آن کلونيهاي سفيد يا خاکستري فاقد رنگدانه توليد ميکنند. گفته شده است تشديد توليد رنگدانه در استافيلوکوکوس توسط اضافه کردن شير، چربي يا گليسرول مونواستات به محيط کشت القا ميشود. کلونيهاي استافيلوکوکوس اپيدرميديس در جداسازي اوليه معمولا خاکستري تا سفيد هستند. بسياري از کلونيها همراه با گرمخانه گذاري طولاني مدت توليد رنگدانه ميکنند. در محيط مايع و فاقد اکسيژن هيچ رنگدانهاي توليد نميشود (وين و همکاران، 2006 و بروکس و همکاران، 2010). کلونيهاي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس در انسان و گاو زرد طلايي هستند. کلونيهاي بعضي از استافيلوکوکوسهاي کواگولاز منفي نيز داراي رنگدانه هستند (کويين و همکاران، 1994).

2-5-2- هموليز:
استافيلوکوکوس اورئوس چهار نوع هموليزين آلفا (α)، بتا (β)، گاما (γ) و دلتا (δ) را توليد ميكند كه بررسي نقش اين هموليزينها بهعنوان عوامل حدت در مطالعات مختلفي نشان داده شده است (ويسمان، 1975 وآربوثنوت، 1981). اكثر سويههاي حاد استافيلوکوکوس اورئوس كه ازمنابع انساني جدا شدهاند توليد توكسين α ميكنند (الک و لوي، 1950)، همچنين جدايههاي مولد توكسين آلفا با تورم پستان قانقاريايي در گاو نيز در ارتباط ميباشند و مطالعات مختلف در موش و خرگوش نشان داده كه موتانتهايي كه قادر به توليد توكسين آلفا نيستند داراي قدرت بيماريزايي كمتري بوده و انجام واكسيناسيون با توكسين آلفا، باعث محافظت ميزبان ميشود (ادلام و همکاران، 1977، جانسون و همکاران، 1985 و منزيس و کرنودل، 1996).
توکسين آلفا يک پروتئين ناهمگون است که بر روي طيف گستردهاي از غشاي سلولهاي يوکاريوت موثر است. توکسين آلفا يک هموليزين قوي است. توکسين بتا اسفنگوميلين را تخريب کرده و براي بسياري از سلولها از قبيل گلبولهاي قرمز انسان اثرات کشنده دارد. توکسين دلتا ناهمگون بوده و در مجاورت پاک کنندههاي غير يوني، به چند زير واحد شکسته ميشود، غشاهاي بيولوژيک را پاره ميکند و احتمالا در بيماريهاي اسهالي استافيلوکوکوس اورئوس نقشي بر عهده دارد. هموليزين گاما به مجموعهاي از سه پروتئين گفته ميشود که با دو پروتئين از لکوسيدين پنتون – والنتين8 ترکيب شده و شش پروتئين دوجزئي با توانايي بالقوه سميت را به وجود ميآورد. تمامي اين شش توکسين پروتئيني از راه به وجود آمدن منفذ در غشاهاي سلولي، بهگونهاي موثر گلبولهاي سفيد را ليز کرده و سبب نفوذپذيري آنها نسبت به کاتيونها ميشود (بروکس و همکاران، 2010).
هموليزينهاي استافيلوکوکوس (,β,γ,δα) ميتوانند به تنهايي و يا در ترکيب با هم توليد شوند و يا هرگز توليد نشوند. هموليزينها از لحاظ آنتي ژني، بيوشيميايي و اثرشان بر روي گلبول هاي قرمز گونههاي مختلف حيوانات متفاوت هستند. محيط کشت حاوي اريتروسيتهاي گاو و گوسفند در کارهاي تشخيصي دامپزشکي نسبت به خون ساير حيوانات ترجيح داده ميشود. به علت اينکه گلبولهاي قرمز اين دو گونه حيوان به هموليزينهاي α و β که به طور رايج از جدايههاي استافيلوکوکوس حيواني جدا ميشوند، حساس است. معمولا استافيلوکوکوس اورئوس و استافيلوکوکوس اينترمديوس هر دو هموليتيک هستند و اغلب هموليز α و β و همچنين هموليز دوتايي را نشان ميدهند. استافيلوکوکوسهاي کواگولاز منفي توانايي متفاوتي در توليد هموليز که معمولا به آهستگي ايجاد ميشوند، دارند. جدايههاي استافيلوکوکوس هايکوس9 فاقد هموليز هستند (کويين و همکاران، 1994).
بهطور كلي بر اساس مطالعات انجام شده نتايج ترشح هموليزين بهصورت زير مشخص ميشود:
الف) ناحيه هموليز كامل با لبههاي نا مشخص روي پليت حاوي خون گوسفند و خرگوش مشخص كننده هموليزين آلفا ميباشد.
ب) ناحيه تيره اطراف كلنيها روي پليت حاوي خون گوسفند كه بعد از قرار گرفتن در يخچال كامل ميشود، بهعنوان هموليز بتا شناخته ميشود.
ج) منطقه هموليز كامل با لبههاي كاملاً واضح و مشخص روي پليت حاوي خون گوسفند، خرگوش و اسب مشخص كننده وجود هموليزين دلتا است.
د) در نهايت هموليزين گاما بر اساس توليد يك ناحيه كوچك از هموليز ناقص روي پليت حاوي خون خرگوش مشخص ميشود. قابل توجه است كه اين نوع هموليزين روي پليت حاوي خون گوسفند و اسب اثرات مشخصي را ايجاد نميكند (هاک و بالدوين، 1964).
6-2- تستهاي تشخيص بيماريزايي جدايههاي استافيلوکوکوس:
1-6-2- تست کوآگولاز:
استافيلوکوکوس اورئوس، آنزيم کوآگولاز را توليد ميکند. اين پروتئين يک شبه آنزيم است که پلاسماي سيتراته يا اگزالاته را لخته مي کند. کوآگولاز به پروتئين، پيوند ميشود، مجموعه کوآگولاز و پروترومبين از نظر آنزيمي فعال ميشود و پليمريزه شدن فيبرين را شروع ميکنند.کوآگولاز احتمالا موجب رسوب فيبرين در سطح استافيلوکوکوسها ميشود. احتمالا رسوب فيبرين باعث جلوگيري از بلعيده شدن باکتريها در سلولهاي بيگانه خوار و يا جلوگيري از تخريب آنها در درون اين سلولها ميگردد. توليد کوآگولاز به مفهوم توانايي بالقوه در قدرت تهاجمي و بيماري زايي است.
دو روش براي تست کوآگولاز انجام ميشود:
الف) اسلايد
ب) لوله
برخي از استافيلوکوکوسهاي پاتوژن ممکن است تست کوآگولاز آنها روي اسلايد منفي شود، اما در لوله مثبت شود. برخي از آزمايشگاهها تنها تست لوله را براي کوآگولاز انجام ميدهند.
براي انجام اين تست ميتوان از کلونيهاي رشد يافته روي محيط آگار CNA، آگار حاوي خون يا ديگر محيطهاي غير انتخابي مغذي استفاده کرد، اما نبايد محيطهاي با غلظت بالاي نمک مانند مانيتول سالت آگار باشد، زيرا غلظت بالاي نمک باعث ميشود بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس به طور خودبهخودي ايجاد لخته کنند (وين و همکاران، 2006).
پلاسماي تازه يا فريز و خشک شده تجاري معرفي است که مورد استفاده قرار ميگيرد. پلاسماي خرگوش حاوي فيبرينوژن است که توسط آنزيمهاي کوآگولاز استافيلوکوکوس به فيبرين تبديل ميشود. کوآگولاز متصل با واسطه سلولي بوده و روي لام آزمايش ميشود و کوآگولاز آزاد که در محيط رشد باکتري آزاد ميشود، با تست لوله شناسايي ميشوند.
مادهاي که براي انجام کوآگولاز لوله و اسلايد توصيه ميشود، پلاسماي خرگوش با EDTA10 است. پلاسماي سيتراته نبايد استفاده شود، زيرا ارگانيسمهايي که قادر به استفاده از سيترات هستند (براي مثال گونههاي انتروکوکوس) اگر با استافيلوکوکوس اشتباه گرفته شوند، نتايج مثبت کاذب را نشان ميدهند. ميتوان با انجام تست کاتالاز از اين خطا جلوگيري کرد. پلاسماي انساني (براي مثال مواد از تاريخ گذشته بانکهاي خوني) شامل مقادير متفاوتي از CRF11 وآنتي باديهاي ضد استافيلوکوکوس است و نبايد در تست کوآگولاز استفاده شوند (وين و همکاران، 2006).
الف)تست کوآگولاز روي اسلايد:
يک لوپ پر از کشت استافيلوکوکوس در يک قطره آب روي لام حل ميشود. يک لوپ پر از پلاسماي خرگوش اضافه شده و به خوبي با سوسپانسيون باکتريايي مخلوط ميشود. اسلايد به آرامي تکان داده ميشود. اگر پس از 2-1 دقيقه لخته شد، نشان دهنده واکنش مثبت است (کويين و همکاران، 1994).

ب) تست کوآگولاز در لوله:
براي اين منظور 5/0 ميلي ليتر از پلاسماي خرگوش در يک لوله کوچک آزمايش ريخته ميشود و سپس 2 قطره از محيط مايع کشت شبانه استافيلوکوکوس و يا از سوسپانسيون غليظ باکتري در محيط کشت آگار در آب استريل به آن اضافه ميشود. لوله را به آرامي ميچرخانيم تا محتويات آن مخلوط شوند و سپس در دمايC° 37 ترجيحا در حمام آب گرم گرمخانه گذاري ميشود. تس

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید