دانلود پایان نامه

و پتانسیل بیماریزایی باکتری می باشد (بروکس و همکاران، 2010).
2-تست کاتالاز
این آنزیم موجب تسهیل در عمل تبدیل آب اکسیژنه سمی (H2O2 ) ناشی از متابولیسم به آب و اکسیژن میگردد و این آنزیم میتواند استافیلوکوکها را از اثر کشنده H2O2 که توسط ماکروفاژها تولید میشود محافظت کند (داس و بیشای، 2009).
3-تست DNase
این محیطیک محیط تفریق کننده است. در این آزمایش توانایی باکتری در تولید آنزیم DNase مشخص میشود )کوین و همکاران، 1994).
6-13-2- واکنش زنجیرهای پلیمراز65
1-اصول و مبانی PCR
واکنش زنجیرهای پلیمراز برای اولین بار توسط کری مولیس (دسامبر1983) توصیف گردید و به تدریج کاربردهای زیادی در بیولوژی مولکولی پیدا کرد (شاه حسینی و همکاران، 1380). امروزه PCR یکی از ابزارهای اساسی علوم بیولوژی است و کاربردهای بسیار فراوانی در حیطههای مختلف علوم بیولوژی مولکولی و به ویژه تشخیص بیماریهای عفونی پیدا کرده است.PCR بر اساس تکثیر قطعات DNA هدف توسط آنزیم مقاوم به گرما (مانند آنزیم پلی‌مراز Taq 66) و رشتههای کوتاه نوکلئوتیدی (پرایمر) میباشد (شاه حسینی و همکاران، 1380).
2-آمادهسازی نمونهها
در واکنش زنجیرهای پلیمراز مواد مختلفی مورد استفاده قرار میگیرد که هر کدام نقش منحصر بفردی در واکنش ایفا میکنند و نتیجه نهایی، حاصل استفاده صحیح از مجموعه این مواد میباشد که به شرح آنها پرداخته میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– DNA الگو:
کیفیت نمونه DNA، نتیجه نهایی PCR را به شدت تحت تاثیر قرار میدهد. مثلا حضور مقادیر زیاد RNA موجب جذب یون منیزیوم شده و بازده نهایی PCR را تحت الشعاع قرارمیدهد. نمونه ناخالص ممکن است حاوی عوامل مهارکننده پلی‌مراز باشد که موجب کاهش بازدهی واکنش میگردد. سالم بودن نمونه DNA نیز اهمیت فراوانی در نتیجه واکنش دارد به همین منظور میتوان برای کنترل کیفیت DNA آن را در ژل آگارز الکتروفورز کرد. اگر یک نمونه برای اولین بار در آزمون PCR مورد استفاده قرار میگیرد توصیه میشود یک نمونه مثبت که اندازه آن نیز مشخص است در کنار نمونهها مورد آزمایش قرار گیرد. میزان نمونه موجود در واکنش نیز در کارآیی PCR حائز اهمیت است (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– پرایمر:
توالی و غلظت پرایمرها در واکنش تاثیر زیادی دارد. همچنین لازم است که نقطه ذوب دو پرایمر یکسان یا نزدیک به هم باشد. غلظت های 6/0-1/0 میکرومولار از پرایمر برای واکنش مطلوب میباشد، غلظتهای زیادتر پرایمر موجب تکثیر قطعات غیر اختصاصی شده و غلظتهای کم پرایمر باعث تمام شدن آن قبل از اتمام واکنش میشود و این موضوع نیز باعث کاهش مقدار محصول خواهد شد. مقدار مورد نیاز پرایمرمتناسب با مقدار DNA مصرف میشود که اغلب معادل یک میکروگرم به ازای 100 میکرولیتر مخلوطPCR میباشد (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).

– آنزیمDNA پلیمراز:
متداولترین آنزیم برای PCRهای معمولی، DNA پلی‌مراز Taq است که معمولا بین 5/0 تا 5/2 واحد در 50 میکرولیتر مخلوط PCR استفاده میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– MgCl2:
یون منیزیوم با اتصال به dNTPها، مجموعه محلولی را ایجاد میکند که به عنوان سوبسترا یا آنزیم DNA پلیمراز عمل می‌کند. برای حصول بهترین نتیجه، غلظت نهایی MgCl2 را به شکل تجربی به دست میآورند. این غلظت برای واکنشهای PCR بین 1 تا 5/1 میلیمولار میتواند در نوسان باشد. متداولترین غلظت MgCl2 در واکنشها 5/1 میلیمولار (با غلظت 200 میکرومولار هر کدام از dNTP ها) میباشد. یون منیزیم فعالیت آنزیمی را تحت تاثیر قرار داده و افزایش آن باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمرها به DNA الگو و ایجاد باندهای غیراختصاصی در واکنش میگردد (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– dNTPs:
تنظیم مقدار متعادل هر چهار dNTP موجب کاهش اشتباه عمل آنزیم پلی‌مرازمیشود. اگر در واکنشی مجبور به افزایش مقدار dNTPs باشید بایستی مقدار MgCl2 نیز افزایش یابد. زیرا افزایش dNTPs موجب کاهش یون منیزیوم محلول شده و در نتیجه احتمال اتصال پرایمر به DNA هدف کاهش مییابد. مناسبترین غلظت dNTPs،200 میکرومولار در نظرگرفته میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– بافر:
جهت حفظ pH واکنش در محدوده مناسب استفاده میشود و انواع متنوعی دارد که بسته به شرایط و نوع PCR انتخاب میشوند (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383). در بین مواد ذکر شده که جهت انجام PCR لازم هستند فقط dNTPs و پرایمرها در واکنش مصرف میشوند، بنابراین غلظت بیشتر dNTPs سبب افزایش محصول و همچنین مقدار مناسب و حتی بیشتر پرایمر سبب اطمینان در اتصال پرایمر به تمامی نواحی مکمل خود روی DNA الگو میشود که این هم باعث افزایش محصول خواهدشد (شاه حسینی و همکاران،1380؛ کریمی و همکاران،1383؛ مدرس موسوی بهبهانی،1389).

3- چرخههای حرارتی
ابتدا یک مرحله واسرشت سازی جهت جهت جداسازی دو رشته DNA بمدت 5-3 دقیقه صورت میگیرد و سپس سه مرحله حرارتی به شرح زیر اعمال میشود:
1- واسرشت سازی67
اين مرحله اولين مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محيط به ميزان 94 تا 98 درجه سانتیگراد به مدت 20 تا 30 ثانيه است. اين عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همديگر)، هم DNA الگو و همDNA پرايمر از طريق از بين رفتن باندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدهاي دو رشته DNA و توليد DNA تک رشتهاي میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).

2- اتصال68
در اين مرحله دماي واکنش به 50 تا 65 درجه سانتیگراد به مدت 20 تا 40 ثانيه کاهش مي يابد تا امکان اتصالDNA پليمراز و پرايمر به DNA الگو که حالا تک رشته اي است فراهم شود. بطور معمول درجه حرارت اتصال حدود 3 تا 5 درجه سانتیگراد کمتر از دمای ذوب شدن پرايمر انتخاب ميشود. مناسبترين اتصالDNA-DNA بين رشته الگو و پرايمر زماني ايجاد ميگردد که هر دو رشته در فاصله نزديکي از هم قرار گيرند و هرچه توالي پرايمر با توالي رشته الگوي متناسبتر باشد اين اتصال قويتر بوده و اتصال قوي جهت انجام عمل پليمراز مورد نياز است (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).

3- بسط69
دمای اين مرحله به نوع آنزيم DNA پليمراز مورد استفاده و درجه حرارت مناسب مورد نياز براي فعالیت آن بستگي دارد. بطور مثال آنزيم DNA پليمراز Taq در درجه حرارت 75 تا 80 درجه سانتيگراد فعاليت قابل قبول داشته ولي بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتيگراد براي اين آنزيم استفاده ميشود. در اين مرحله آنزيم DNA پليمراز نوکلئوتيدهاي مکمل را بر اساس رشته الگو از جهت 3َ- 5َ در کنار هم قرار داده و در نهايت رشته مکمل رشته الگوي اوليه را توليد ميکند. مدت زمان اين مرحله به نوع آنزيم DNA پليمراز و طول رشتهDNA الگو بستگي دارد. در شرايط مساعد براي مثال اگر محدوديت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دو برابر ميشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383
4-آشکارسازی70 و تجزیه و تحلیل الگوی باندهای DNA
الکتروفورز ژل آگارز به عنوان روش معمول جهت جداسازی DNA و RNA در علوم بیوشیمی و بیولوژی مولکولی، کاربرد دارد. این روش بر مبنای حرکت مولکول های اسید نوکلئیکباردار منفی در بستر آگارز در حضور میدان الکتریکی ثابت (الکتروفورز) میباشد که متعاقب آن قطعات مولکول DNA بر حسب اندازهشان از یکدیگرتفکیک میگردند (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
5- رديابي محصول PCR
جهت ديدن محصول PCR در ژل بايد از آگارزهاي استاندارد (DNA-grade) استفادهنمود. با اين حال، آگارزهای با قدرت تفكيك بالا (مثلFMC Bioproducts Nusieve) توانايي جداسازي و مشاهده قطعات Kbp 2-bp 10 را دارند و جهت تفكيك بهتر محصولات كوچك PCR، ميتوان از آنها استفاده نمود. براي محصولات كوچك از نظر اندازه، يا تفكيك بين محصولات كوچك و نزديك از لحاظ اندازه، از ژل پلي آكريلاميد استفاده مي‏شود (شاه حسینی و همکاران،1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
ميتوان محصول PCR را در طي واكنش تكثيري (براي مثال با اضافهنمودن dNTPهاي نشاندارشده به مواد راديواكتيو يا فلورسنت يا بيوتين) نشاندار نمود. محصول سپس بوسيله الكتروفورز در ژل و در معرض قراردادن فيلم رادیولوژی و يا بوسيله آشكارسازي خاصيت فلورسنس و يا با استفاده از سيستم آشكارسازي اويدين/ استرپتاويدين شناسايي مي‏گردد(شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
تكثير همزمان و آشكاركردن توالیهاي DNA ويژه، بوسيله اضافه كردن رنگ هايی که با DNA واکنش میدهند مانند اتيديوم برومايد در PCR، عملي مي‏باشد. چون خاصيت فلورسنس اتيديوم برومايد در حضور DNA دو رشته‏اي افزايش مي‏يابد. همچنین علاوه بر کاربرد فوق میتوان از اتیدیوم بروماید جهت شناسايي محصول دورشته‏اي بعد از تكثير نیز استفاده نمود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).

14-2- مروری بر تحقیقات انجام شده
تحقیق انجام شده توسط آرمین و همکاران (2007) روی 284 نفر (193 زن و 91 مرد) برای بررسی آلودگی به استافیلوکوکوس آرئوس صورت گرفت که در میان آنها 237 نفر (5/83 درصد) از کارگران بهداشت و درمان و 5 نفر دیابتی و 1 نفر دیالیزی بودند. استافیلوکوکوس آرئوسدر56 نفر(7/19 درصد) مشاهده شد که شامل 37 زن (2/19 درصد) و 19 مرد (7/20 درصد) بود. هیچ ارتباطی بین عفونت استافیلوکوکوس آرئوسی با جنس، سن و سال اشتغال مشاهده نشد. MRSA در 23 نفر (1/8 درصد) که شامل 16 مرد و 7 زن بود مشاهده شد.
تحقیق انجام شده توسط امین زاده و همکاران (2006) نشان میدهد که از 96 بیمار همودیالیزی، 44 نفر (45 درصد) حامل استافیلوکوکوس آرئوس در بینی خود بودند. همهی استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده به متیسیلین مقاوم بودند، در حالی که 95 درصد به کلوکساسیلین، 81/6 درصد به کلیندامایسین، 81/6 درصد به سیپروفلوکساسین و 5/4 درصد به ریفامپین مقاوم بودند، با این حال همهی جدایهها به وانکومایسین حساس بودند.
در تحقیق رحیمی و همکاران (2009) نشان داده شد که از 558 نفر، 321 نفر (7/54 درصد) آلوده به استافیلوکوکوس آرئوس بودند که از این میان، 66، 65، 88، 88، 100، 41، 38، 41، 0، 40، 93، 20 و 64 درصد استافیلوکوکوس آرئوسها به کانامایسین، سفوتاکسیم، متیسیلین، اگزاسیلین، آمپیسیلین، اریترومایسین، کلیندامایسین، سولفامتوکسازول-تریمتوپریم، وانکومایسین، کلرامفنیکل، سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و تتراسایکلین مقاوم بودند. همهی MRSA ها و 63 درصد از باکتریهای جدا شده حامل ژن mecA بودند.
در مطالعهی صادری و همکاران (2009) نشان داده شد که جدایههای MRSA، 49 درصد از همهی جدایهها بودند در حالی که تنها 7/1 درصد از جدایهها که حساس به متیسیلین (MSSA) بودند به چند دارو مقاوم بودند. نشان داده شد که همهی MRSAها به حداقل 5 آنتی بیوتیک مقاوم بودند. اکثر جدایهها از بیماران بالای 65 سال بودند. MRSA و شیوع آن بیشتر در میان استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از نمونههای تنفسی بود، همچنین شیوع MRSA در بخش مراقبتهای ویژه بیشتر از بخشهای دیگر بود.

فصل سوم
مواد و روش کار

مواد و روش کار
1-3- مواد و وسایل مورد نیاز
1-1-3- کشت باکتری
محیطهای کشت از جمله بلاد آگار، مانیتول سالت آگار، DNase آگار71، تریپتوز سوی براث72، مولر هینتون آگار73، اسکولین بایل سالت آگار74و مالتوز براث75 استفاده شد.
2-1-3- رنگ آمیزی گرم
جهت رنگ آمیزی گرم از محلول ها و معرف های

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید