دانلود پایان نامه

کریستال ویوله76، محلول لوگول، الکل اتیلیک (اتانول)، رنگ سافرانین77 و استون استفاده شد.
3-1-3- بررسی مقاومت آنتیبیوتیکی
دیسکهای آنتیبیوتیکی پنی سیلین (10)، اریترومایسین (15)، تتراسایکلین (30)، جنتامایسین (10)، وانکومایسین (30)، آمپی سیلین (10)، ایمیپنم (10)، آموکسی سیلین (25)، سفتی زوکسیم (30)، متیسیلین (10) و اگزاسیلین (1) (padtan Teb co.) جهت بررسی مقاومت آنتیبیوتیکی استفاده شد.
4-1-3- استخراج DNA
– جهت استخراج DNA از کیت سینا ژن استفاده شد.
– جهت سانتریفیوژ کردن مواد از دستگاه اسپکترافیوژ78 شرکت لب نت79 استفاده شد.
5-1-4- PCR
موادPCR شامل: آب، بافر، پرایمر، منیزیم کلراید (MgCl2)، dNTPs، آنزیم Taq DNA polymerase، DNA و lader میباشد. جهت مشاهدهی محصول از تانک الکتروفورز، ژل آگاروز، اتیدیوم بروماید، بافر TAEو بافر بارگذاری استفاده شد، همچنین برای انجام آن از دستگاه ترموسایکر BIO – RAD استفاده شد.
2-3- روش کار
1-2-3- نمونه گیری
تعداد 80 نمونه از 4 منبع مختلف ورم پستان، مواد غذایی، عفونتهای انسانی و اسکناس انتخاب شد. این باکتریها قبلا برای پروژههای دیگری جدا شده و در کلکسیون بخش میکروب شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز نگهداری میشدند.
2-2-3- کشت میکروبی
برای حصول اطمینان، تمام این جدایهها بر روی محیطهای کشت زیر و به روش معمول و براساس آزمایشهای مختلف بیوشیمیایی مورد تایید قرار گرفتند. برای این منظور آزمایشات زیر به ترتیب انجام شد:
– کشت روی محیط بلاد آگار و بررسی همولیز
– انجام رنگ آمیزی گرم
– انجام تست های کواگولاز، کاتالاز و اکسیداز
– کشت روی محیطهای مانیتول سالت آگار، DNase آگار، تریپتوز سوی براث، مولر هینتون آگار، اسکولین بایل سالت آگار و مالتوز براث
نتایج این آزمایشات رویاستافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از منابع مختلف مواد غذایی، ورم پستان، اسکناس و عفونتهای انسانی صورت گرفته است، به صورت جداول 1-4، 2-4، 3-4 و 4-4 در فصل چهارم گزارش شده است.
نتایج مورد انتظار حاصل از آزمایشات فوق در جدول 1-3 گزارش شده است:

Biochemical Tests

Coagulase
Catalase
Oxidase
Hemolysis
DNase
Mannitol fermentation
Maltose fermentation
Aesculin hydrolysis
Results
+
+

+
+
+
+

جدول 1-3: نتایج مورد انتظار حاصل از آزمایشات نام برده

الف – آزمون کواگولاز

به روش اسلاید انجام گرفت:
يك قطره از پلاسماي خرگوش كه با استفاده ازEDTA تهيه شده روي يك لام خشك و تميز قرار داده میشد. يك قطره آب مقطر يا سرم فيزيولوژي در نقطه مجزائي به عنوان كنترل قرار داده میشد. بااستفاده از لوپ استريل مقداري از كلني باکتری در هر يك از قطرات فوق به صورت سوسپانسيون مخلوط میشد. سپس از نظر تجمع باكتريها بررسي میشدند.

ب -آزمون کاتالاز
یک قطره از محلول 3% پراکسید هیدروژن را بر روی لام قرار داده و مقداری از باکتری در آن حل میشد. پیدایش حباب (در اثر آزاد شدن اکسیژن) بیانگر مثبت بودن آزمایش می باشد.

ج -آزمون اکسیداز
روی یک لام یک قطعه کاغذ صافی گذاشته، سپس محلول 1 درصد Tetramethyl-Phenylenediaminedihydrochloride روی آن ریخته و با استفاده از پیپت پاستور یک کلنی از باکتری برداشته میشد و روی کاغذ صافی پخش میشد. بعد از 15 ثانیه نتیجه تست قرائت میشد. در صورتی که این آنزیم در میکروارگانیزم وجود داشته باشد تحت تاثیر این آنزیم معرف به رنگ بنفش (آبی) ظاهر می شود.

3-2-3- آماده سازی محیطهای کشت
جهت آماده سازی محیط های کشت طبق دستور العملهای شرکت سازنده [(مرک آلمان و Antec Diagnostic (ATD)] به میزان مورد نیاز از پودر مورد نظر در مقدار مناسب آب مقطر حل میشد. محیط TSB به لولههای آزمایش انتقال مییافت. سپس محیطهای ساخته شده (بلاد آگار، مانیتول سالت آگار، مالتوز براث، DNase آگار، اسکولین بایل سالت آگار و TSB) در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه استریل میشدند. پس از استریل شدن و سرد شدن محیط های آگار تا دمای 40 تا 50 درجه سانتی گراد در دمای اتاق، این محیطها در زیر هود به پلیتهای استریل منتقل میشدند.
الف- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط DNase آگار
یک کلنی از باکتریاستافیلوکوکوس آرئوس به صورت یک خط مستقیم روی محیط DNase آگار با لوپ کشت داده میشد ونتیجه بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرائت میگردید.

ب- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مانیتول سالت آگار
یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مانیتول سالت آگار با لوپ کشت داده میشد و نتیجه بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرائت میگردید.
ج – کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط اسکولین بایل سالت آگار
این محیط به صورت شیبدار است. یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس به صورت یک خط مستقیم روی محیط اسکولین بایل سالت آگار با لوپ کشت داده میشد و نتیجه بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرائت میگردید.
د- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مالتوز براث
یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس با لوپ در محیط مالتوز براث کشت داده میشد و نتیجه بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرائت میگردید.
پس از تایید جدایهها، آزمایشات زیر بر روی استافیلوکوکوس آرئوس های جدا شده از منابع نام برده شده صورت میگرفت:
– تعیین حساسیت باکتریها نسبت به آنتیبیوتیکها (آنتیبیوگرام)
– استخراج DNA
– واکنش زنجیرهای پلیمراز

4-2-3- آنتیبیوگرام
بدلیل به وجود آمدن مقاومت آنتیبیوتیکی باید عملکرد آنتیبیوتیکها روی باکتریها بررسی شود. ابتدا از کلنی باکتریهای مورد نظر توسط لوپ در داخل لولههای حاوی محیط TSB کشت داده میشد. لولههایی به نام مک فارلند80 استاندارد وجود دارد که هر کدام دارای کدورت خاصی و از شمارهی 5/0 تا 10 است. در اینجا از کدورت 5/0 استفاده میشد که درجهی کدورت این لوله 5/0 مک فارلند باید با درجهی کدورت لولهیحاوی TSB که باکتری مورد نظر در آن رشد یافته یکسان باشد.
الف- کشت باکتری ها روی محیط مولر هینتون آگار و قرار دادن دیسکهای آنتیبیوتیکی روی محیط:
این محیط برای رشد باکتریهای گرم مثبت و منفی مناسب است. محیط مغذی است. سوسپانسیون در کنار شعله به کمک سواب استریل آغشته به سوسپانسیون در محیط کشت مولر هینتون آگار به شکل سفرهای به طوری که کاملا سطح محیط آغشته شود پخش میشد و برای چند دقیقه در دمای اتاق قرار میگرفت تا سطح محیط خشک شود. آنتیبیوتیکها به شکل دیسکهای کاغذی که مشخصاتشان روی دیسک تعبیه شده است، می باشد. مشخصات شاملنام اختصاصی آنتیبیوتیک و شمارهای که نشان دهندهی مقدار آنتیبیوتیک است، میباشد. آنتیبیوتیکها با کمک پنس استریل با فواصل معین روی محیط قرار داده میشد. بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد نتایج قرائت میگردید به این صورت که با کمک خط کش از قسمت پشت پلیت قطر هالهها اندازهگیری میشد جداول استاندارد وجود دارد که برای هر باکتری و هر آنتیبیوتیک قطرها در عدم رشد معلوم است. و سپس نتایج با جداول مطابقت داده شدند.
5-2-3- استخراج DNA
جهت استخراج DNA از کیت DNA سیناژن استفاده شد. استخراج طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام میگرفت که به اختصار بدین شرح بود:
– کشت باکتری ها در محیط مایع که در اینجا از TSB استفاده میشد و به مدت 24-18 ساعت گرمخانهگذاری میشدند.
– نمونه باکتری ها در میکرو تیوبهای 2 میلیلیتری ریخته میشدند و با سرعت rpm 4000 و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ میشدند.
– مایع رویی دور ریخته میشد.
– 100 میکرولیتر Prelysis Buffer اضافه میشد.
– 20 میکرولیتر Lysosyme اضافه و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه گرمخانهگذاری میشدند.
– 10 میکرولیتر Ributinase اضافه و در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه گرمخانهگذاری میشدند. .
– 400 میکرولیتر Lysis Buffer اضافه و به مدت 20 ثانیه ورتکس میشدند.
– 300 میکرولیتر Precipation Buffer اضافه و به مدت 5 ثانیه ورتکس میشدند.
– سوسپانسیون به Spin Columns با تیوپهای جمعآوری انتقال داده میشدند.
– در rpm 13000 برای 1 دقیقه سانتریفیوژ و تیوپهای جمعآوری دور انداخته میشدند.
– Spin Column ها به تیوپهای جمعآوری جدید انتقال داده میشدند.
– 400 میکرولیتر Wash Buffer | اضافه میشد.
– در rpm 13000 برای 1 دقیقه سانتریفیوژ و تیوپهای جمعآوری دور انداخته میشدند.
– Spin Column ها به تیوپهای جمعآوری جدید انتقال داده میشدند.
– 400 میکرولیتر Buffer ||Wash اضافه میشد.
– در rpm 13000 برای 1 دقیقه سانتریفیوژ و تیوپهای جمعآوری دور انداخته میشدند.
– Spin Column ها به تیوپهای جمعآوری جدید انتقال داده میشدند.
– مرحله اضافه کردن Buffer ||Wash تکرار میشد.
– 30 میکرو لیترElution Buffer که در دمای 8 تا 20 درجه سانتیگراد نگهداری شده بود و سپس به مدت 5-3 دقیقه در 65 درجه سانتی گراد گرم شده بود واضافه میشد.
– Spin column ها در rpm 13000 برای 1 دقیقه سانتریفیوژ میشدند و DNA استخراج شده با حجم نهایی 30 میکرولیتر در فریزر 20- نگهداری میشد. .
6-2-3- روش انجام آزمون PCR:
آزمون PCR اختصاصی ژن mecA در حجم نهایی 2/25 میکرولیتر، شامل 3 میکرولیتر از DNA استخراج شده، 5/2 میکرولیتر بافر AMS (Fermentas / Lithuania)، 75/0 میکرولیتر کلرید منیزیم، 1 میکرولیترdNTP، 1 میکرولیتر از پرایمرهای اختصاصی (جدول 2-3)، و در نهایت 2/0 واحد آنزیم Taq DNA polymerase، مطابق شرایط زیر تکثیر میشد:
– مرحله واسرشتی اولیه: دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه
-واسرشتی، تکثیر ژن و کشیدگی به ترتیب در دماهای 95، 55 و 72 درجه سانتیگراد هر کدام به مدت یک دقیقهدر 34 سیکل
– کشیدگی نهایی: 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه
7-2-3- رد یابی محصول PCR
در نهایت 7 میکرولیتر از محصول PCR در ژل آگاروز 1 درصد، پس از افزودن 5/. میکروگرم اتیدیوم بروماید در هر میلیلیتر ژل الکتروفورز شدند. به منظور مشاهدهی باندهای مورد نظر، ژلهای الکتروفورز شده با دستگاه ترانسایلومیناتور81 تحت اشعه UV بررسی و باندهای ایجاد شده (449 bp) با مارکر شرکت سازنده مقایسه شدند.

جدول 2-3: توالی الیگونوکلوتیدی پرایمرها (شیتو و همکاران، 2006)
قطعهی تکثیر یافته ( bp )
توالی پرایمر
( ′3→′5 )
ژن هدف
449
( mecA1 ) : CTC AGG TAC TGC TAT CCA CC
( mecA2 ) : CAC TTG GAT TAT CTT CAC C
mecA

فصل چهارم
نتایج

نتایج
نتایج مطالعه حاضر در 3 بخش تستهای بیوشیمیایی، آنتیبیوگرام و PCR گردآوری شد که در این فصل گنجانده شده است.
نتایج تستهای بیوشیمیایی استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از منابع مختلف ورمپستان، مواد غذایی، اسکناس و انسانی
این نتایج به صورت جداول 1-4، 2-4، 3-4 و 4-4 این فصل گزارش شده است که نشان میدهد تمام باکتریهای جدا شده از منابع مورد بررسی طبق تستهای بیوشیمیایی که شامل کواگولاز، کاتالاز، اکسیداز، DNase، هیدرولیز اسکولین و کشت روی محیط مانیتول سالت آگار و در مالتوز براث برای بررسی تخمیر قندهای مانیتول و مالتوز میباشد، استافیلوکوکوس آرئوس بودند.

1-4- بررسی نتایج تستهای بیوشیمیایی در استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از نمونههای ورمپستان
همانطور که در جدول 1-4 مشاهده میشود تمام استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از نمونههای ورمپستان کواگولاز،

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید