دانلود پایان نامه

بنابراين در گاز حامل ترکيب‌ها به طور جداگانه از ستون خارج گرديده و پس از وارد شدن در دتکتور ثبت مي‌شوند. تشخيص اجزاء به دست آمده از روي زمان بازداري آن‌ها صورت مي‌گيرد به اين ترتيب هر جسمي در شرايط (RT) ثابتي دارد و با در دست داشتن استانداردهايي از اجزاء سازنده اسانس‌ها عمل تشخيص صورت مي‌گيرد. البته کروماتوگرافي گازي اسانس‌ها به طور معمول جدايي کامل تمام اجزاء موجود را در يک‌بار ارائه نمي‌دهد و پيک اجزاء هيدروکربن‌ها اغلب با ترکيب‌هاي اکسيژن‌دار روي هم23 مي‌افتند و به طور معمول براي شناسايي و خالص کردن ترپن‌هاي فرار موجود در فرآورده‌هاي گياهي از روش‌هاي ديگر مانند Liquid – Solid – Chromathography و به ويژه کروماتوگرافي لايه نازک (TLC) کمک گرفته مي‌شود . براي تعيين ساختمان ترپن‌هاي جدا شده بايد طيف مادون قرمز (FR) و هم چنين طيف‌سنج جرمي (Mass) آن موجود باشد و در اصل مي‌توان دو تکنيک کروماتوگرافي لايه نازک (TLC) و کروماتوگرافي گازي را در تجزيه ترپن‌ها مکمل يکديگر دانست و حتي در مورد سزکوئي ترپن‌ها هم که کم فرار هستند، کروماتوگرافي لايه نازک (TLC) بهترين تکنيک مي‌باشد. امروزه براي جداسازي و تشخيص اجزاء موجود در اسانس از ادغام دو دستگاه کروماتوگرافي گازي و طيف‌سنج جرمي (GC/MS) استفاده مي‌گردد و ليکن در آزمايشگاه‌هايي که امکانات کافي و دستگاه‌هاي پيشرفته وجود ندارد، هنوز هم از روش کروماتوگرافي ستوني و تقطير فراکسيوني و تهيه مشتقات آن‌ها به عنوان روش‌هاي تحقيق جهت جداسازي و تشخيص مواد تشکيل‌دهنده اسانس‌ها استفاده مي‌شود (احمدي و همکاران، 1380).
نمونه به حالت مايع با حجمي معادل چند دهم ميکروليتر (1/0 ميکروليتر)، به شکل يک جرياني توپي (Plug Flow) و توسط سرنگ‌هاي ميکروليتري ابتدا به قسمت تزريق وارد و پس از تبخير در اين قسمت با فشار اعمال شده از طرف گاز حامل (هليوم، ازت يا هيدروژن) داخل قسمت جداسازي (ستون) مي‌گردد. با عبور نمونه از داخل ستون، اجزاء موجود در آن که هر کدام حلاليت معيني در فاز ثابت دارند، بر اساس قانون تعادل بين اين فاز و فاز گازي، توزيع مي‌شوند. از جنبه‌ي نظري، هر قدر تعداد تعادل‌هاي انجام شده بين دو فاز بيشتر باشد، بازده يک ستون کروماتوگرافي بيشتر بوده و جداسازي (‌Resolution) بهتر و مطلوب‌تري به دست خواهد آمد. بازده يک ستون کروماتوگرافي به پارامترهاي مختلفي بستگي دارد که از ميان آن‌ها طول و قطر داخلي ستون و هم‌چنين ضخامت فيلم فاز ثابت (GLC) يا قطر ذرات جامد و نحوه‌ي توزيع آن‌ها داخل ستون (GSC) و ترکيب شيميايي اين فاز از بيشترين اهميت برخوردار مي‌باشند. ستون‌هايي که در ابتدا مورد استفاده قرار مي‌گرفتند و امروزه نيز در موارد خاصي به کار مي‌روند، به ستون‌هاي پر شده (Packed Columns) معروف هستند. اين ستون‌ها داراي طول 20-2 متر و قطر داخلي 8-1 ميلي‌متر مي‌باشند. تعداد تعادل‌هاي انجام شده در بهترين نوع اين ستون‌ها حداکثر به 20000 يا کمي بيشتر (N 20000) مي‌رسد، در حالي که ستون‌هاي جديد که به ستون‌هاي مويينه (Capillary Columns) معروف بوده و اعتبار و ارزش بالاي کروماتوگرافي گازي به مقدار قابل توجهي مرهون پيشرفت در تکنولوژي ساخت چنين ستون‌هايي مي‌باشد، واجد قطر داخلي 5/0 – 25/0 ميلي‌متر و طولي برابر يکصد متر يا بيشتر مي‌باشند و فاز ثابت نيز به صورت لايه‌ي بسيار نازکي به ضخامت 25/0 ميکرون (و گاهي کمتر) در سطح داخلي آن‌ها توزيع شده است. در اين نوع ستون‌ها تعداد تعادل‌هاي انجام شده که به تعداد سيني‌هاي نظري نيز معروف است، گاهي از 100000 نيز تجاوز مي‌کند که نشانگر بازده بالاي اين ستون‌ها نسبت به ستون‌هاي پر شده مي‌باشد. اجزاء خارج شده از ستون، يکي پس از ديگري وارد آشکارساز شده و در آن‌جا توسط مکانيسمي که به نوع آشکارساز مورداستفاده بستگي دارد، علائمي به ازاي هر جزء نشان داده مي‌شود که پيک (Peak) نام دارد. هر پيک واجد دو مشخصه بوده که اولي، زمان ظهور آن و دومي سطح زير منحني متناظر با آن به شمار مي‌رود. مشخصه‌ي اول براي شناسايي کيفي (‌تعيين نام جزء) و مشخصه‌ي دوم براي شناسايي کمي (تعيين غلظت مربوط به آن جزء)‌ به کار مي‌روند (احمدي و همکاران، 1378).
3-2-4-2- شناسايي ترکيبات فرار
جهت تجزيه ترکيبات فرار در اسانس گونه‌هاي مختلف مرزه از GC و GC/MS استفاده شد. تجزيه GC، توسط دستگاه A Agilent 7890 و نوع ستون HP-5MS 5% (طول ستون m30، قطر داخلي ستون m 25/0، قطر بيروني ستون mm 25 /0) انجام شد. گاز حامل هليوم با سرعت ml/min8/0 جريان داشت. دماي اوليه‌ي ستون C 60 و دماي نهايي ستون C 280 بود . افزايش دما تاC/min 4 برنامه‌ريزي شد. نسبت جداسازي 40:1 تنظيم شد. دماي تزريق‌کننده C 300 بود. خلوص گاز هليوم 999/99? بود. جهت تزريق نمونه‌ها از ميزان 1/0 ميکروليتر اسانس با استفاده از سرنگ ميلتون استفاده شد. تجزيه GC/MS توسط دستگاهC 5975 Agilent انجام شد. انرژي يونيزاسيون در طيف‌سنج جرمي 70 الکترون ولت انتخاب شد . طيف جرمي از 50-550 m/z بود. شاخص‌هاي بازداري (IR) براي تمام اجزا با استفاده از يک‌سري هومولوگ از ان – آلکان‌ها (C5-C24) که در شرايط مشابه شرايط نمونه‌ها تزريق شدند، محاسبه گرديد. شناسايي اجزاي اسانس بر اساس مقايسه‌ي دفعات بازداري آن‌ها با دفعات بازداري استانداردهاي معتبر و نيز با مقايسه‌ي الگوهاي تجزيه‌اي طيفي جرم آن‌ها انجام شد (Adams, 2007).

شکل3-6- دستگاه GC/MS(عکس از نگارنده)
3-3- روش محاسبات آماري
به منظور تجزيه و تحليل آماري اطلاعات به دست آمده از تحقيق حاضر، از طرح کاملاً تصادفي (يک‌طرفه ـ يک‌سويه) با 3 تکرار با استفاده از نرم‌افزار آماري SPSS نسخه‌ي 19 انجام شد. در نهايت مقايسه‌ي ميانگين با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد مورد مقايسه قرار گرفتند و با استفاده از نرم‌افزار Excel, Office 2007 نمودارهاي مربوطه رسم گرديد.

فصل چهارم
نتايج و بحث

4-1- خصوصيات اکولوژيکي دو گونه مرزه بختياري و کلاري

مرزه کلاري و مرزه بختياري به ترتيب از منطقه‌ي کوه کلار و سبزکوه واقع در استان چهارمحال و بختياري به ترتيب در زمان گل‌دهي (برگ‌ها به همراه 10? گل‌دهي) و قبل از گل‌دهي (برگ‌ها به همراه ساقه‌ها) در تيرماه 1391 جمع‌آوري گرديد. ميانگين دماي کوه کلار و سبزکوه به ترتيب 43/10 و 88/10 درجه سانتي‌گراد و متوسط مجموع بارندگي به ترتيب 367 و 5/447 ميلي‌متر مي‌باشد. ويژگي‌هاي بافت خاک در اين مناطق عبارتند از: کوه کلار داراي اسيديته‌ي خاک 47/7، ماده‌ي آلي خاک 204/2 درصد، شوري خاک 509/0 دسي زيمنس بر متر، و داراي 0/35 ? رس، 0/48 ? سيلت و0/17 ? شن مي‌باشد و منطقه‌ي سبزکوه داراي اسيديته‌ي 60/7، ماده‌ي آلي خاک 79/2 درصد، شوري خاک 62/0 دسي زيمنس بر متر و داراي 24? شن، 40? سيلت و 36? رس مي‌باشد. کوه کلار در ارتفاع 2116 متر از سطح دريا و منطقه سبزکوه در ارتفاع 2292 متر از سطح دريا قرار دارد. گياهان همراه مشاهده شده با اين دو گونه در محل جمع‌آوري عبارت از: Viola rupestris Rosea. ،Potentilla speciosa Willd. ،Fresen. Phagnalon nitidum،Phagnalon rupestre L.،DC. pentanema Pulicariiforme ، Boiss. Tanacetum dumosum ، Rosularia elymetica (Boiss.& Hausskn.) Bornm.‌، Dionysia revolute Boiss.،( schlecht.) Boiss. ferulago angulata بودند.
با توجه به مشاهدات به عمل آمده در تحقيق حاضر مي‌توان چنين بحث کرد که دو گونه‌ي مرزه کلاري و بختياري در ارتفاع بيشتر از 2000 متر رويش دارند و اغلب رويشگاه‌هاي طبيعي مرزه بختياري سنگلاخي و داراي خاک بسيار سبک مي‌باشند بنابراين يکي از شرايط اکولوژيکي مهم اين گياه زهکشي خاک و اراضي با خاک سبک مي‌باشد.
4-2- عملکرد اسانس
عملکرد اسانس زردرنگ مرزه کلاري 15/0 ميلي‌ليتر در 100 گرم ماده خشک اندام هوايي و نيز عملکرد اسانس در مرزه بختياري، مرزه زراعي و مرزه خوزستاني به ترتيب 39/1، 7/0، 53/0 ميلي‌ليتر در 100 گرم ماده خشک مي‌باشد. عملکرد اسانس مرزه بختياري که يکي از گونه‌هاي اندميک در همان زيستگاه مرزه کلاري است 71/1 ميلي‌ليتر در 100 گرم ماده خشک گزارش شده است (Ghasemi Pirbaloti et al., 2013). به علاوه، عملکرد اسانس به دست آمده از ساير گونه‌هاي اندميک مرزه به ترتيب 2? از S. laxiflora C. Koch (et al., 2004 Sonboli)، 2-3? ازS. khuzestanica Jamzad (Sefidkon and Ahmadi, 2000‌) و 7/1-3/3? از . Bornm S. sahendica (Akbarnia et al., 2009) گزارش شده است. عملکرد اسانس در S. boliviana Briq. 27/0? و در S. parvifolia (Benth) Briq. 57/0? گزارش شده است (v/w نمونه تازه) (Viturro et al .,2000 ). در مطالعه‌اي ديگر، عملکرد اسانس به دست آمده 7/1? برايS. montana L. و 3/0? براي S. cuneifolia Ten. حجم به وزن خشک گزارش شده است (Skocibusic and Bezic, 2004).
نتايج تحقيق حاضر نشان مي‌دهد که اسانس گياه مرزه بختياري در مقايسه با سه گونه مرزه ديگر تفاوت معني‌دار دارد اما مرزه کلاري داراي عملکرد اسانس کمتري در مقايسه با ساير گونه‌هاي مرزه مي‌باشد (نمودار 4-1).
جدول4-1- نتايج حاصله از تجزيه واريانس ميزان عملکرد اسانس
منابع تغيير )S.O.V(
درجه آزادي
)df (
مجموع مربعات
) SS(
ميانگين مربعات
) MS(

)F(
گونه
3
**074/2
** 691/0
470/6
خطا
7
748/0
107/0

کل
10
822/2
798/0

نمودار4-1- مقايسه ميانگين ميزان عملکرد اسانس با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد (حروف مشابه بيانگر عدم اختلاف معني‌دار است.)

4-3- تجزيه فيتوشيميايي اسانس
4-3-1- مرزه کلاري
ترکيبات شيميايي توسط GC و GC-MS شناسايي شدند و بر اساس زمان بازداري بين آن‌ها در جدول (4-2) آورده شده‌اند. به طور کلي، 12 ترکيب در اسانس مرزه کلاري شناسايي گرديد که 9/91? ترکيبات را شامل مي‌شود. تجزيه اسانس 3 ترکيب اصلي را مشخص نمود که شامل: پيپريتنون اکسيد (2/71?)، ليمونن (7/6 ?)، و پيپريتنون (4/5?) مي‌باشد. اسانس مرزه کلاري شامل هيدروکربن‌هاي مونوترپن (7/6?)، اکسيدهاي مونوترپن (1/80?)، هيدروکربن‌هاي سزکويي ترپن (4/3?) و سزکويي ترپن‌هاي اکسيژنه (7/1?) است. به طور کلي، مونوترپن‌ها ترکيب اصلي اسانس از اندام‌هاي هوايي مرزه کلاري به همراه 8 مشتق شناسايي شده، 8/86 ? اسانس را نشان دادند. 15 گزارش از 20 گونه مرزه از کشورهاي مختلف براي مقايسه ترکيبات شيميايي اسانس انتخاب شد (جدول4-3). بيشترين ترکيب شيميايي اسانس اغلب گونه‌هاي مرزه ترپنوييدهاست (جدول4-3). به طور مشابه نتايج دو مطالعه (Viturro et al., 2000 ; Niemeyer, 2010) نشان داد که ترکيبات اصلي اسانس‌هايS. darwinii (Benth) Briq . و S. parvifolia از شيلي و آرژانتين به ترتيب پيپريتنون (8/57?) و پيپريتنون اکسيد (8/69?) دارند. در حالي که بيشترين ترکيبات در اسانس ساير گونه‌هاي مرزه گاما ترپينن، پارا سيمن، کارواکرول وتيمول گزارش شده‌اند (جدول 4-3).

شکل4-1- کروماتوگراف حاصل از تزريق اسانس مرزه کلاري به دستگاه کروماتوگرافي گازي

جدول4- 2 – ترکيبات شيميايي مرزه کلاري
ترکيب
(RI (cal)) شاخص بازداري
(محاسبه شده)
(RI (Lit))
شاخص بازداري
(بر اساس شاخص کواتس)
(Adams, 2007)
حداکثر سطح (?)
مونوترپن‌ها
هيدروکربن‌ها
1- ليمونن‌
الکل‌ها
2- لينالول
3- آلفا ـ ترپينئول
4- ميرتنول
کتون‌ها
5- کامفور
6-

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید